5氟尿嘧啶上調干細胞標記物CD133在結腸癌細胞中的表達
隨著中國生活水平的提高，結直腸癌的發病率不斷上升。在美國，結直腸癌所致的死亡位于癌癥所致死亡的第二位[1]。 新藥研發改善了轉移性結直腸癌患者的總體生存，然而，對于大多數晚期患者而言，治療依然是姑息性的[2]。最近的證據表明，結腸癌由一組異質性的細胞組成，這些細胞的致腫瘤形成的能力不同。腫瘤起始細胞亦稱腫瘤干細胞（Cancer Stem Cell，CSC）定義為能啟動并形成腫瘤的細胞，而且這些細胞能通過其表面的標記物被識別，CD133就是其中的標記物[3]。 CD133（Prominin-1）是5跨膜蛋白家族的首個成員，含865個氨基酸，有胞外N端，胞內C端，兩個大的胞外環含8個糖基化的位點。盡管CD133 已經用于分離各種腫瘤的干細胞（包括結腸癌），其功能還不得而知[4]。
5氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是消化系統腫瘤的基礎用藥，尤其是結直腸癌，所有的化療方案都含氟尿嘧啶類藥物，即使在疾病發展較緩慢，或者存在嚴重的合并癥而使用單藥治療的患者，也必定使用5-FU，而不是其他有效的細胞毒藥物如奧沙利鉑或者伊立替康。根據腫瘤干細胞的理論，常規的細胞毒藥物只能殺滅快速增長的細胞，而CSC對細胞毒藥物耐藥， 從而導致腫瘤的復發及轉移。那么，傳統的化療藥物如5-FU到底對結腸癌干細胞有怎么樣的影響？本文擬通過5-FU對結腸癌干細胞標記物CD133的作用探討5-FU對結腸癌干細胞的影響，同時論證腫瘤干細胞的理論應用于在結腸癌細胞株中。
材料及方法
1 試劑
5-FU購于Sigma公司，將其溶于雙蒸的水中制成100g/ml濃度的儲存溶液，置于-20oC 的冰箱中備用，根據需要稀釋成不同濃度的實驗溶液。
2 細胞培養
6個結腸癌細胞株DLD1、HT29、HCT116、SW480、Lovo、RKO（由華盛頓大學干細胞中心Moon教授的實驗室提供）培養于含100u/ml的青霉素和鏈霉素的10% DMEM中（Invitrogen），置于5% CO2的培養箱中在370c下培養，用于實驗的細胞最多傳代10次。
3 細胞活性測定及計數
新型四唑氮鹽方法（MTS）通過線粒體功能測定細胞活性，試劑盒為CellTiter Aqueous Assay Kit (Promega)。細胞以3,000 cells/well/100µl的濃度種于96孔板的培養皿，限制性稀釋的方法將5-FU加入各個孔中，形成倍增的濃度梯度。48h后，加入20µLMTS，370c孵育1-4h，然后在ELISA機器490nm下讀數，以空白對照為參照，計算出細胞活性的百分比。所有試驗設平行三組，獨立重復三次。
4 流式細胞儀分析（Fluorescence Activated Cell Analysis, FACS）
單個細胞混懸液與anti-CD133/2 (293C3-PE, Miltenyi)10：1 或者異構體對照 (mouse IgG2b -PE)10：1混合40C下染色30分鐘，PBS洗脫后加入7AAD(BD Biosciences)以排除死細胞對結果的影響，上流式細胞儀(FACS Canto II,BD Biosciences)檢測CD133陽性細胞的比例，所有試驗設平行三組，獨立重復三次。
5 磁珠細胞分離（Magnetic Activated Cell Separation, MACS）
單個混懸的細胞與anti-CD133/1磁珠微粒40C下混合(AC133, mouse IgG1, cell isolation kit, Miltenyi)30分鐘，洗脫后通過磁柱，陽性細胞被吸附，而陰性細胞直接流過柱子，然后將陽性的細胞洗出。磁性分離后，臺盼蘭染色評估細胞活性，分離后的細胞以流式細胞儀檢測陽性細胞和陰性細胞的純度。細胞與anti-CD133/2 (293C3-PE, Miltenyi) 或者異構體對照 (mouse IgG2b -PE)混合染色30分鐘，洗脫后加入7AAD(BD Biosciences)以排除死細胞對結果的影響，上流式細胞儀(FACS Canto II,BD Biosciences)檢測CD133陽性細胞的比例，所有試驗設三組并獨立重復三次。
6 細胞克隆形成實驗
MACS方法將DLD1細胞分為DLD1CD133+和DLD1CD133-兩群細胞后，限制性稀釋的方法將細胞稀釋成1個/孔的濃度種植于96孔板，各3板，每3d更換培養液，10d后在顯微鏡下計算克隆形成的數量。
7 實時定量PCR（qPCR）
Qiagen試劑盒提取總RNA，Invitrogen逆轉錄酶逆轉錄成cDNA。與Taqman探針混合后在ABI PRISM 7300HT的機器(Applied Biosystems)進行PCR反應，引物為Hs01009257_m1 prominin1, 或者內源性對照4333762T ACTB(Applied Biosystems)。反應條件為：95℃10min，然后50×15s 95℃，60℃ 1min。相對定量通過比較Ct。數據處理和統計使用軟件ABI PRISM SDS version 2.1 (Applied Biosystems)。所有試驗設三組并獨立重復三次。
8 統計分析
t檢驗比較兩組間的差別。當P值小于0.05被認為是有統計學差異，數據以平均值±標準差( ±S)的方式顯示。
結果
1 CD133在各個細胞株中的表達情況
FACS的方法檢測結腸癌細胞株DLD1、HT29、SW480、HCT116、Lovo、RKO中CD133的表達情況，如圖1所示，其表達率分別為30.2%、82%、0.34%、91.8%、85.3%、0.28%。其中只有DLD1細胞中有兩個明顯分開的細胞群分別為DLD1CD133+和DLD1CD133-，HT29中幾乎所有的細胞都表達CD133，因此，以下的實驗選取DLD1和HT29為主要研究對象。
5-FU劑量依賴性抑制結腸癌細胞生長：為了最佳的選用體外使用5-FU濃度，我們以MTS方法測定梯度5-FU濃度對HT29、DLD1細胞增殖的影響。細胞活性的測定在48h后，如圖2所示，5-FU對HT29和DLD1的抑制都成劑量依賴性，IC50約為10µg/ml。
2 CD133陽性的細胞克隆生長能力較CD133陰性的細胞強
DLD1細胞明顯有CD133陽性和CD133陰性，陽性的細胞比例為30.87%±2.51%，如圖2A所示。通過MACS方法分離后陽性細胞群中CD133陽性細胞比例為87.21%±5.33%, 而陰性細胞群中陰性細胞的比例為84.3%±4.65%（圖3A），DLD1細胞分為DLD1CD133+和DLD1CD133-兩群細胞后，限制性稀釋的方法將未分離和分離后的三群細胞以1個/孔的濃度種植于96孔板，各3板，10天后在顯微鏡下計算克隆形成的數量，結果顯示DLD1、DLDCD133+和DLDCD133-細胞形成的克隆數分別為：39.67%±5.62%、46.33%±4.44%、31%±2%，DLDCD133+和DLDCD133-細胞之間的克隆形成能力比較有統計學差異，P=0.04，如圖3B所示。兩群細胞形成的克隆如圖3C、3D所示。
3 CD133陽性的細胞對5-FU敏感性下降
MACS方法分離DLD1細胞后，DLD1、DLDCD133+和DLDCD133-細胞被不同濃度的5-FU處理，濃度梯度為0 µg/ml、6.25 µg/ml、12.5 µg/ml、25 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml，48h后MTS方法測定三群細胞的活性，結果顯示三條曲線基本平行，未分離的DLD1細胞位于中間，DLD1CD133+細胞的曲線在其他兩條曲線的上方，與DLD1CD133-細胞相比，對5-FU的敏感性顯著下降20%，P <0.01,圖4。
4 5-FU上調結腸癌細胞中CD133mRNA水平
兩組濃度的5-FU 1µg/ml、5-FU 10µg/ml處理HT29和DLD1，48h后RT-PCR的方法檢測藥物處理后CD133mRNA水平的變化，未處理的DLD1mRNA水平相對量為1，5-FU 1µg/ml 處理后DLD1細胞mRNA水平從1分別變為1.684±0.012(p=0.001), HT29細胞從30.702±0.28分別變為49.379±0.46(p=0.002)。5-FU 10µg/ml處理后DLD1和HT29細胞CD133mRNA水平分別變為0.877±0.010(p=0.43)，40.318±0.38(p=0.07)。5-FU 1µg/ml的濃度能顯著增加CD133mRNA在兩種細胞株中表達，且與處理前相比有統計學差異。
討 論
盡管治療策略不斷發展，綜合應用目前所有對轉移性結直腸癌有效的藥物，晚期結直腸癌患者的平均生存期只有20-24個月，其治療依然只是姑息性的［2］。
因此進一步探討結直腸癌的發生學理論，靶向某些對腫瘤生長起決定性作用的細胞群是關鍵。腫瘤干細胞的理論認為，腫瘤起始細胞對傳統的細胞毒藥物耐藥，對放療不敏感，在傳統治療中存活從而導致了腫瘤的復發和轉移。根據腫瘤干細胞理論的模型，未來發展方向將是研發針對這些對治療不敏感的腫瘤干細胞的藥物，可能為治愈腫瘤帶來新的希望。
多種不同類型的細胞中，CD133是成人干細胞表面膜的標記物，其表達意味著細胞干性的保持[4]。從外周血中分離的CD133陽性的細胞能用于骨髓移植，CD133陽性的細胞能分化成肌肉細胞和心肌細胞等等[7]。腎臟分離出來的CD133陽性的細胞在體內外有自我更新的能力，可通過向腎臟上皮和內皮細胞分化而再生腎臟[8]。最近，CD133被認為是多種腫瘤干細胞的標記物，包括結腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌和腦惡性膠質瘤中[7]。盡管其蛋白功能還不太明確，由于是一個腫瘤干細胞的標記物，用于分離腫瘤干細胞能有助于尋找靶向治療腫瘤干細胞的靶點。
Bao等從惡性膠質瘤細胞中分離了CD133陽性的腫瘤干細胞，發現這些細胞對離子型的放療不敏感，可能是由于DNA修復功能強[9]。Woodward等也發現乳腺癌的干細胞對放療不敏感[10]，Todaro等發現CD133陽性的細胞對5-FU和奧沙利鉑的敏感性下降[11]。本研究將結腸癌細胞株DLD1中的兩群細胞通過MACS的方法分離，發現CD133陽性的細胞在克隆形成能力方面較CD133陰性的細胞強，說明CD133陽性的細胞體外自我更新的能力比陰性的細胞強；通過MTS方法發現陽性細胞對5-FU的敏感性下降，也與干細胞對傳統化療藥物耐藥的假設；并且5-FU導致干性標記物CD133mRNA水平的表達上調，與腫瘤干細胞的假設相符，即傳統的細胞藥物殺滅快速分裂的細胞（CD133陰性細胞），而無法殺滅腫瘤干細胞，那么在細胞毒藥物處理細胞后，腫瘤干細胞（CD133陽性）所占的比例將上調，表現為其標記物表達的上調，說明5-FU能富集CD133高表達的結腸癌干細胞，能為將來靶向治療干細胞提供一種富集的方法。
本研究通過探討從腸癌細胞中分離CD133陽性的細胞群，并證實陽性細胞自我更新能力強，對傳統化療藥物不敏感，證明了腫瘤干細胞的理論在結腸癌細胞株中應用。5-FU能富集結腸癌腫瘤干細胞群。針對腫瘤干細胞的治療將給治療晚期癌癥的患者帶來新的希望。
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