惡性腦膠質瘤U87細胞系腫瘤干細胞放療

敏感性的體外實驗研究

趙紅宇1，徐 東1，李 帥1，王 倩2，劉海君3，金 輝4，劉云會1*

（1 中國醫科大學盛京醫院神經外科，沈陽110004；2 中國醫科大學93期；3 中國醫科大學93期七年制；4 中國醫科大學臨床藥理實驗室）

摘要：目的 探討腦膠質瘤細胞系U87細胞及其腫瘤干細胞（CSCs）對體外放療的敏感性。方法 應用神經干細胞（NSCs）培養基分離培養形成細胞球克隆，檢測細胞球細胞的NSCs特性。采用不同劑量放射線照射U87細胞及其CSCs，應用集落形成實驗和生存曲線檢測其生存情況。結果 U87細胞在NSCs培養基中形成懸浮的細胞球克隆，具有自我更新和多向分化能力，表達CD133、Nestin；兩種細胞的存活率均隨照射劑量增加而下降，且CSCs的存活率明顯高于U87細胞（P<0.01）。 結論 在體外條件下，CSCs的放射敏感性明顯低于U87細胞，其可能是惡性腦膠質瘤放療抵抗的主要原因。

關鍵詞：腦膠質瘤，惡性；U87細胞系；腫瘤干細胞；放療敏感性

中圖分類號：R 文獻標志碼：A 文章編號：1002-266X(2011)25

Research on radiosensitivity of malignant glioma U87 cell line cancer stem cells in vitro

ZHAO Hong-yu, XU Dong, LI Shuai, WANG Qian, LIU Hai-jun, JIN Hui, LIU Yun-hui

（1 Department of Neurosurgery, The Shengjing Hospital, China Medical University,Shenyang 110004, China）

Abstract：Objective Investigate radiosensitivity of glioma cell line U 87 cells and cancer stem cells (CSCs) in vitro. Methods U87 cell was cultured in neural stem cells medium (NSCs-medium), NSCs-medium was used to isolate spheres from primary cultured tumor cells derived from U87 cell line, and was identified as CSCs U87 cells. CSCs were irradiated by X-rays with different doses, respectively. Colony-forming experiment was used to detect cell survival, and survival curves were drafted, respectively.  Results U87 cells formed suspension in serum-

基金項目：國家自然科學基金資助項目（30700861）；遼寧省教育廳科研項目計劃（L2010601）。

*通訊作者

free stem cell medium and proliferated into the clonal sphere.The clonal spheres presented strong self-renewal and multipotency ability, and expressed specific marker CD133, Nestin. The cell survival curves showed that the survival rates decreased along with increased irradiation doses, and the ratios of cell clone formation in CSCs subpopulation was higher than in U87 cell significantly（p<0.01）. Conclusion Radiosensitivity of CSCs is strikingly lower than that of U87 cells in vitro, which may be the culprit of malignant glioma radioresistance.

Key words： Glioma; Malignant; U87 cell line; cancer stem cells;Radiosensitivity

惡性腦膠質瘤是最常見的惡性程度最高的中樞神經系統腫瘤，占中樞神經系統腫瘤的60%以上，雖經放療、化療及手術治療等多種治療手段的干預，但死亡率仍一直居高不下，惡性膠質瘤患者的中位生存期僅為14.6個月，成為困擾神經外科醫生的一個難題[1]。近來研究表明，在膠質瘤內部，存在著一個小的細胞亞群-腫瘤干細胞（Cancer stem cells, CSCs），它們具有干細胞的特性，能夠進行自我更新、多向分化及體內致瘤，是腫瘤發生、發展的根源[2]。在腦膠質瘤CSCs成功分離與鑒定的基礎上，不斷有學者提出CSCs的治療策略[3]。2007～2008年，我們在成功分離、鑒定U87惡性膠質瘤CSCs的基礎上，檢測了腦膠質瘤細胞系U87細胞及其CSCs的體外放療敏感性，旨在探討CSCs在惡性膠質瘤放療抵抗性中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1. 1 材料 腦膠質瘤細胞系U87細胞（中國科學院），DMEM/F12培養液 (Invitrogen 公司), 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (GIBCO 公司)。NSCs標記物鑒定試劑盒(NSCs marker characterization kit, Chemicon公司)包括：小鼠抗人CD133單抗,小鼠抗人Nestin單抗，小鼠抗人微管相關蛋白2（MAP2）單抗，兔抗人膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）多抗，小鼠抗人O1單抗。Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(Chemicon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 U87細胞的培養和傳代 U87細胞接種于含 10%胎牛血清的 DMEM / F12 培養基中 ,在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。5～7 d后，按 1∶2或 1∶3的比例傳代。

1.2.2 CSCs的培養和傳代 U87細胞接種于含B27（20µg/ml）、肝素( 5mg/ml)、EGF (20ng/m l)和 bFGF (20ng/m l)的無血清DMEM / F12培養液中 ,在 37℃、5%CO2 的飽和濕度培養箱中培養。待U87細胞增殖形成細胞球3、4d后 ,吸取上清液體培養液 (含細胞球 )重新吹打成單細胞懸液 ,按1∶2或1∶3的比例傳代。

1.2.3 CSCs的鑒定 原代細胞球形成并達到100~200個細胞之后，收集這些細胞球，應用0.1%胰蛋白酶 (trypsin) 和1×EDTA在37℃下處理10min，細胞球被分解成為單細胞并轉移到96孔培養皿進行培養，稀釋細胞懸液達到1~2個細胞/孔，觀察單細胞克隆能力。將細胞離心后種植于預涂漬的盒式載玻片中，以2%多聚甲醛固定，室溫下15min；10%驢血清封閉，室溫下1h。以NSCs標記物鑒定試劑盒進行細胞染色，室溫孵育2h；加入Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗 (1:250)，室溫孵育1h。熒光顯微鏡下隨機選擇20個高倍視野進行陽性細胞計數。

1.2.4 實驗分組及照射干預 兩種細胞均各自以隨機數字法設立對照組及照射組，對照組不進行照射，照射組進一步分為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0Gy劑量組。均在室溫下用西門子Primus-M型直線加速器進行照射。

1.2.5 集落形成實驗 分別收集兩種細胞制成懸液，加入24孔培養皿中，每平皿接種400個細胞，對照組及照射組細胞均在37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養7d后，用95%乙醇固定，0.25%結晶紫染色，并計數>50個細胞的集落，計算集落形成率及細胞存活分數（SF，SF=照射組集落形成率/對照組集落形成率）.

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，組間率的比較用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U87細胞的生長及CSCs的形成與增殖 在FBS的DMEM/F12培養基中，U87 細胞呈貼壁生長并交織成網狀。將在含10%FBS的DMEM/F12培養基中單層貼壁生長的細胞，轉移到無血清的干細胞培養基中培養5~7天后，一小部分細胞自我增殖成呈球狀或卵球狀懸浮的細胞球克隆，每球約有100~200個細胞。初代的細胞球細胞分解成單細胞后，重新在干細胞培養液中培養，細胞均能形成2代細胞球。

2.2 CSCs的鑒定 細胞球細胞表達NSCs的表面標記物CD133、Nestin，而不表達星形細胞標記物GFAP和神經元標記物MAP2，極少表達少突膠質細胞標記物O1。大部分分化細胞表達GFAP，少數細胞表達MAP2 和O1。

2.3 X線照射對U87 細胞及CSCs的影響作用比較 照射組照射0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0Gy劑量時，U87細胞及CSCs的存活率分別由1%逐漸降至0、0.2%。隨著照射劑量增加，U87細胞及CSCs的存活率均下降。且CSCs的存活率高于U87細胞（P<0.01）。

3 討論

近年研究表明[4,5]，惡性腦膠質瘤內具有NSCs特性的細胞亞群CSCs，在腫瘤發生、發展中發揮了決定性作用。這些細胞在體外可形成克隆球，具有多向分化及體內致瘤能力。本研究結果顯示，惡性腦膠質瘤細胞系U87細胞及CSCs接受X線照射后，其細胞存活率均下降，且隨著放射劑量增加而細胞存活率下降；并發現在同一劑量放射線干預下，U87細胞的存活率明顯低于CSCs。表明U87細胞系CSCs的放射敏感性明顯低于U87細胞，CSCs具有明顯的放療抵抗性。

目前，應用傳統的抗腫瘤放療手段雖能抑制腫瘤細胞增殖，但其是作用短暫，且腫瘤容易復發。近年研究認為，因CSCs較其他分化的腫瘤細胞具有更強的放療抵抗性，故放射線干預僅能殺滅或抑制腫瘤中的非腫瘤干細胞，而對其CSCs則較少或無治療作用[6]。本研究結果證實了這一現象。

放射生物學理論認為，DNA作為放射線對細胞作用的關鍵靶點，在放療機制中發揮重要的作用;DNA損傷程度可反映放療敏感性的強弱，DNA損傷后迅速修復是放療抵抗性的關鍵原因[7]。Bao等[8]研究發現，在放射劑量干預下，CSCs的相對比例增加CSCs的存活比例明顯高于腫瘤細胞；并發現CSCs的放療抵抗性增高是通過優先激活檢查點蛋白實現的，應用檢查點激酶（Chk1、Chk2）的特異性抑制劑能抑制CSCs的DNA損傷修復，逆轉CSCs的放療抵抗性。提示CSCs的放射敏感性可能與影響細胞周期調控及信號轉導通路改變有密切關系。

綜上所述，根據CSCs的放療抵抗特性，尋找特異性針對CSCs的治療手段，有可能從根本上遏制腫瘤生長；探索針對CSCs的放射增敏，將成為腫瘤放療極具前途的發展方向。

參考文獻:

[1] Stupp R, Mason W P, van den Bent M J, et al. Radiotherapy plus con2comitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med, 2005, 352 (10): 9872-9996.

[2] 蘇進,許新華.腫瘤干細胞生物學特性及相關研究進展[J].腫瘤防治研究, 2010, 37(4): 474-476.

[3] 張勝平，黃金，鄧興力，等. 腦膠質瘤干細胞基因靶向治療研究緊張[J].國際神經病學神經外科學雜志, 2010, 37(1): 25-28.

[4] 李明武,牛朝詩,董永飛,等.腦腫瘤干細胞的增殖活性與病理級別的相關性研究[J].中華神經外科疾病研究雜志, 2009, 8(6): 542-546.

[5] Ehtesham M, Mapara KY, Stevenson CB, et al. CXCR4 mediates the proliferation of glioblastoma progenitor cells[J]..Cancer Lett, 2009, 274(2): 305-312.

[6] Johannessen TC, Bjerkvig R, Tysnes BB. DNA repair and cancer stem-like cells --potential partners in glioma drug resistance[J].? Cancer Treat Rev, 2008, 34(6): 558-567.

[7] 谷銑之,殷蔚伯,余子豪,等.腫瘤放射治療學[M].4版.北京:中國協和醫科大學出版社, 2008:231-232.

[8] Bao S, Wu Q, McLendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J]. Nature, 2006, 444(7120): 756-760.

  Tag: 臍帶血| 臍帶| 臍帶幹細胞| 脂肪幹細胞| 胎盤幹細胞| 羊胎水| 抗衰老| 

惡性腦膠質瘤U87細胞系腫瘤干細胞放療

敏感性的體外實驗研究

趙紅宇1，徐 東1，李 帥1，王 倩2，劉海君3，金 輝4，劉云會1*

（1 中國醫科大學盛京醫院神經外科，沈陽110004；2 中國醫科大學93期；3 中國醫科大學93期七年制；4 中國醫科大學臨床藥理實驗室）

摘要：目的 探討腦膠質瘤細胞系U87細胞及其腫瘤干細胞（CSCs）對體外放療的敏感性。方法 應用神經干細胞（NSCs）培養基分離培養形成細胞球克隆，檢測細胞球細胞的NSCs特性。采用不同劑量放射線照射U87細胞及其CSCs，應用集落形成實驗和生存曲線檢測其生存情況。結果 U87細胞在NSCs培養基中形成懸浮的細胞球克隆，具有自我更新和多向分化能力，表達CD133、Nestin；兩種細胞的存活率均隨照射劑量增加而下降，且CSCs的存活率明顯高于U87細胞（P<0.01）。 結論 在體外條件下，CSCs的放射敏感性明顯低于U87細胞，其可能是惡性腦膠質瘤放療抵抗的主要原因。

關鍵詞：腦膠質瘤，惡性；U87細胞系；腫瘤干細胞；放療敏感性

中圖分類號：R 文獻標志碼：A 文章編號：1002-266X(2011)25

Research on radiosensitivity of malignant glioma U87 cell line cancer stem cells in vitro

ZHAO Hong-yu, XU Dong, LI Shuai, WANG Qian, LIU Hai-jun, JIN Hui, LIU Yun-hui

（1 Department of Neurosurgery, The Shengjing Hospital, China Medical University,Shenyang 110004, China）

Abstract：Objective Investigate radiosensitivity of glioma cell line U 87 cells and cancer stem cells (CSCs) in vitro. Methods U87 cell was cultured in neural stem cells medium (NSCs-medium), NSCs-medium was used to isolate spheres from primary cultured tumor cells derived from U87 cell line, and was identified as CSCs U87 cells. CSCs were irradiated by X-rays with different doses, respectively. Colony-forming experiment was used to detect cell survival, and survival curves were drafted, respectively.  Results U87 cells formed suspension in serum-

基金項目：國家自然科學基金資助項目（30700861）；遼寧省教育廳科研項目計劃（L2010601）。

*通訊作者

free stem cell medium and proliferated into the clonal sphere.The clonal spheres presented strong self-renewal and multipotency ability, and expressed specific marker CD133, Nestin. The cell survival curves showed that the survival rates decreased along with increased irradiation doses, and the ratios of cell clone formation in CSCs subpopulation was higher than in U87 cell significantly（p<0.01）. Conclusion Radiosensitivity of CSCs is strikingly lower than that of U87 cells in vitro, which may be the culprit of malignant glioma radioresistance.

Key words： Glioma; Malignant; U87 cell line; cancer stem cells;Radiosensitivity

惡性腦膠質瘤是最常見的惡性程度最高的中樞神經系統腫瘤，占中樞神經系統腫瘤的60%以上，雖經放療、化療及手術治療等多種治療手段的干預，但死亡率仍一直居高不下，惡性膠質瘤患者的中位生存期僅為14.6個月，成為困擾神經外科醫生的一個難題[1]。近來研究表明，在膠質瘤內部，存在著一個小的細胞亞群-腫瘤干細胞（Cancer stem cells, CSCs），它們具有干細胞的特性，能夠進行自我更新、多向分化及體內致瘤，是腫瘤發生、發展的根源[2]。在腦膠質瘤CSCs成功分離與鑒定的基礎上，不斷有學者提出CSCs的治療策略[3]。2007～2008年，我們在成功分離、鑒定U87惡性膠質瘤CSCs的基礎上，檢測了腦膠質瘤細胞系U87細胞及其CSCs的體外放療敏感性，旨在探討CSCs在惡性膠質瘤放療抵抗性中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1. 1 材料 腦膠質瘤細胞系U87細胞（中國科學院），DMEM/F12培養液 (Invitrogen 公司), 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (GIBCO 公司)。NSCs標記物鑒定試劑盒(NSCs marker characterization kit, Chemicon公司)包括：小鼠抗人CD133單抗,小鼠抗人Nestin單抗，小鼠抗人微管相關蛋白2（MAP2）單抗，兔抗人膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）多抗，小鼠抗人O1單抗。Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(Chemicon公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 U87細胞的培養和傳代 U87細胞接種于含 10%胎牛血清的 DMEM / F12 培養基中 ,在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。5～7 d后，按 1∶2或 1∶3的比例傳代。

1.2.2 CSCs的培養和傳代 U87細胞接種于含B27（20µg/ml）、肝素( 5mg/ml)、EGF (20ng/m l)和 bFGF (20ng/m l)的無血清DMEM / F12培養液中 ,在 37℃、5%CO2 的飽和濕度培養箱中培養。待U87細胞增殖形成細胞球3、4d后 ,吸取上清液體培養液 (含細胞球 )重新吹打成單細胞懸液 ,按1∶2或1∶3的比例傳代。

1.2.3 CSCs的鑒定 原代細胞球形成并達到100~200個細胞之后，收集這些細胞球，應用0.1%胰蛋白酶 (trypsin) 和1×EDTA在37℃下處理10min，細胞球被分解成為單細胞并轉移到96孔培養皿進行培養，稀釋細胞懸液達到1~2個細胞/孔，觀察單細胞克隆能力。將細胞離心后種植于預涂漬的盒式載玻片中，以2%多聚甲醛固定，室溫下15min；10%驢血清封閉，室溫下1h。以NSCs標記物鑒定試劑盒進行細胞染色，室溫孵育2h；加入Cy3標記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗 (1:250)，室溫孵育1h。熒光顯微鏡下隨機選擇20個高倍視野進行陽性細胞計數。

1.2.4 實驗分組及照射干預 兩種細胞均各自以隨機數字法設立對照組及照射組，對照組不進行照射，照射組進一步分為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0Gy劑量組。均在室溫下用西門子Primus-M型直線加速器進行照射。

1.2.5 集落形成實驗 分別收集兩種細胞制成懸液，加入24孔培養皿中，每平皿接種400個細胞，對照組及照射組細胞均在37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養7d后，用95%乙醇固定，0.25%結晶紫染色，并計數>50個細胞的集落，計算集落形成率及細胞存活分數（SF，SF=照射組集落形成率/對照組集落形成率）.

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，組間率的比較用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U87細胞的生長及CSCs的形成與增殖 在FBS的DMEM/F12培養基中，U87 細胞呈貼壁生長并交織成網狀。將在含10%FBS的DMEM/F12培養基中單層貼壁生長的細胞，轉移到無血清的干細胞培養基中培養5~7天后，一小部分細胞自我增殖成呈球狀或卵球狀懸浮的細胞球克隆，每球約有100~200個細胞。初代的細胞球細胞分解成單細胞后，重新在干細胞培養液中培養，細胞均能形成2代細胞球。

2.2 CSCs的鑒定 細胞球細胞表達NSCs的表面標記物CD133、Nestin，而不表達星形細胞標記物GFAP和神經元標記物MAP2，極少表達少突膠質細胞標記物O1。大部分分化細胞表達GFAP，少數細胞表達MAP2 和O1。

2.3 X線照射對U87 細胞及CSCs的影響作用比較 照射組照射0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0Gy劑量時，U87細胞及CSCs的存活率分別由1%逐漸降至0、0.2%。隨著照射劑量增加，U87細胞及CSCs的存活率均下降。且CSCs的存活率高于U87細胞（P<0.01）。

3 討論

近年研究表明[4,5]，惡性腦膠質瘤內具有NSCs特性的細胞亞群CSCs，在腫瘤發生、發展中發揮了決定性作用。這些細胞在體外可形成克隆球，具有多向分化及體內致瘤能力。本研究結果顯示，惡性腦膠質瘤細胞系U87細胞及CSCs接受X線照射后，其細胞存活率均下降，且隨著放射劑量增加而細胞存活率下降；并發現在同一劑量放射線干預下，U87細胞的存活率明顯低于CSCs。表明U87細胞系CSCs的放射敏感性明顯低于U87細胞，CSCs具有明顯的放療抵抗性。

目前，應用傳統的抗腫瘤放療手段雖能抑制腫瘤細胞增殖，但其是作用短暫，且腫瘤容易復發。近年研究認為，因CSCs較其他分化的腫瘤細胞具有更強的放療抵抗性，故放射線干預僅能殺滅或抑制腫瘤中的非腫瘤干細胞，而對其CSCs則較少或無治療作用[6]。本研究結果證實了這一現象。

放射生物學理論認為，DNA作為放射線對細胞作用的關鍵靶點，在放療機制中發揮重要的作用;DNA損傷程度可反映放療敏感性的強弱，DNA損傷后迅速修復是放療抵抗性的關鍵原因[7]。Bao等[8]研究發現，在放射劑量干預下，CSCs的相對比例增加CSCs的存活比例明顯高于腫瘤細胞；并發現CSCs的放療抵抗性增高是通過優先激活檢查點蛋白實現的，應用檢查點激酶（Chk1、Chk2）的特異性抑制劑能抑制CSCs的DNA損傷修復，逆轉CSCs的放療抵抗性。提示CSCs的放射敏感性可能與影響細胞周期調控及信號轉導通路改變有密切關系。

綜上所述，根據CSCs的放療抵抗特性，尋找特異性針對CSCs的治療手段，有可能從根本上遏制腫瘤生長；探索針對CSCs的放射增敏，將成為腫瘤放療極具前途的發展方向。

參考文獻:

[1] Stupp R, Mason W P, van den Bent M J, et al. Radiotherapy plus con2comitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med, 2005, 352 (10): 9872-9996.

[2] 蘇進,許新華.腫瘤干細胞生物學特性及相關研究進展[J].腫瘤防治研究, 2010, 37(4): 474-476.

[3] 張勝平，黃金，鄧興力，等. 腦膠質瘤干細胞基因靶向治療研究緊張[J].國際神經病學神經外科學雜志, 2010, 37(1): 25-28.

[4] 李明武,牛朝詩,董永飛,等.腦腫瘤干細胞的增殖活性與病理級別的相關性研究[J].中華神經外科疾病研究雜志, 2009, 8(6): 542-546.

[5] Ehtesham M, Mapara KY, Stevenson CB, et al. CXCR4 mediates the proliferation of glioblastoma progenitor cells[J]..Cancer Lett, 2009, 274(2): 305-312.

[6] Johannessen TC, Bjerkvig R, Tysnes BB. DNA repair and cancer stem-like cells --potential partners in glioma drug resistance[J].? Cancer Treat Rev, 2008, 34(6): 558-567.

[7] 谷銑之,殷蔚伯,余子豪,等.腫瘤放射治療學[M].4版.北京:中國協和醫科大學出版社, 2008:231-232.

[8] Bao S, Wu Q, McLendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J]. Nature, 2006, 444(7120): 756-760.

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