血管内皮祖细胞的研究进展
提 要：近几年来，随着对骨组织工程技术治疗骨缺损方面研究的不断深入，对组织工程骨种子细胞，尤其是血管内皮祖细胞的研究也不断深入。本文主要综述了血管内皮祖细胞的来源、生物学中特性、改善血管新生的机制、在骨修复中作用、治疗及应用等方面的研究进展。
骨修复是由多种细胞和细胞外基质共同参与，并受多种生长因子和激素调控的复杂病理生理活动。近年来，骨组织工程技术成为骨缺损修复的研究重点，其研究多集中在种子细胞的选择与培养。血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)最早由Asahara等[1]于1997年报道，这一发现更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论，为缺血性疾病的治疗提供了新的思路[2]。
1 EPCs的来源
现普遍认为,EPCs与造血干细胞起源于共同的干细胞-血液血管母细胞(heman-gioblast)。尽管对EPCs的定义和来源还存在着争议,但多数研究认为,EPCs主要来源于脐静脉血、成人外周血、骨髓[3] ,外周血中的EPCs又起源于骨髓 ,而脐血中的EPCs起源于胎儿的肝脏[4]。正常情况下,EPCs的数量极少,外周血中约为2～3个/mL,脐血中的数量约高3.5倍[5]。在含有血管内皮生长因子(vascular endothelia growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）等适合 EPCs生长的培养条件下,可以大量增殖扩增[6]。从脐血、外周血、骨髓等标本中获得的单个核细胞或CD34、CD133阳性选择后的单个核细胞 ,在体外包被有纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的基底上贴壁培养可形成EPCs,形态为条索状的单层细胞[7]。Asahara等[1]报道，EPCs是一群具有游走特性，CD34、CD133、VEGFR-2+等表面标记阳性，体外培养后能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。它不仅参与胚胎血管生成，而且在脐血、外周血及骨髓中均存在能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管的EPCs[8-9]。
2 EPCs的生物学特性
2.1 EPCs的表面标记
目前对于EPCs的鉴定尚无特异性表面标志，大多学者认为CD34+细胞为造血干细胞和内皮祖细胞共同祖先细胞。Reyes等[3]的研究显示，骨髓中的CD34+、血管内皮钙粘蛋白-、CD133+和Flk1+的多潜能成体祖细胞(multi-potent adult progenitor cell，MAPC)是EPCs的来源。它能在VEGF、FGF、IGF-Ⅰ作用下分化为CD34+、CD133+、VEGFR-2+和Flk1+的成血管细胞，并能继续分化为成熟血管内皮细胞，是重要的内皮细胞来源。最初的研究[10]将EPCs定义为同时表达造血干细胞表面标志CD34和内皮细胞表面标志血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)的细胞。随后,Peichev等[11]发现CD133抗原仅存在于血管内皮前体细胞，成熟内皮细胞不表达CD133，因此，他们将表达CD34+、VEGFR-2+、CD133+的细胞称为功能性血管内皮祖细胞。但有作者提出不同看法，Harraz等[12]在实验过程中发现，CD34-细胞在条件培养液(培养过CD34+细胞的培养液)中逐渐分化出内皮细胞，因此认为CD34+细胞分泌某些未知因子刺激CD34-细胞向内皮细胞分化。Rehman等[13]报道骨髓间充质干细胞和CD34-CD14+的单核细胞在体外经VEGF等诱导也能形成有功能的血管内皮细胞。另外还有从单核巨噬细胞中诱导分化出内皮细胞的报道[14]。
2.2 EPCs的动员
动员骨髓中的祖细胞是由局部环境所决定的。激活如弹力酶、组织蛋白酶G和基质蛋白酶家族(MMPs),通过清除了基质细胞上粘附的结合,与造血干细胞整合素的作用,动员细胞因子阻碍了干细胞和基质细胞之间的相互作用,这最终就允许干细胞通过跨内皮迁移离开骨髓[15]。从生理上讲,一般认为缺血可以成为诱导动员骨髓EPCs的信号。因此,缺血可以上调VEGF,并释放到血循环并通过MMP-9 的依赖诱导动员骨髓的前体细胞。在血液学方面,已经发现包括动员骨髓干细胞其他因素,如从外周血收获造血干细胞而用于骨髓移植。此外, 促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)可以刺激红细胞增殖和成熟,在小鼠和人也可以增加外周血中内皮祖细胞的数量[16]。血清EPO的水平和缺血性心脏病患者骨髓内CD34+或CD133+干细胞之间的关系支持内源性EPO水平作为一个EPCs动员的生理指标而发挥重要作用。但目前还不清楚哪种动员因子对于增加EPCs最为重要。在动物实验中，VEGF165能迅速动员造血干细胞和循环的内皮祖细胞,而血管生成素-1(angiopoietin-1)则诱导了迟发的、较弱的动员内皮和造血祖细胞的作用[17] 。此外,通过动脉保护药物MG-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物)的研究,为药物调节EPCs水平提供了第一个证据。研究[18]表明他汀类药物在体外可以增加小鼠和稳定性冠状动脉疾病患者的EPCs数量和功能活性。他汀类药物可以增加骨髓内干细胞的数量,增加EPCs数量和改善EPCs功能包括EPCs的增殖, EPCs的动员和防止EPCs的衰老和凋亡。
2.3 EPCs的分化
Koyanagi等[19]发现钙黏素E、N表达于共培养体系中EPCs-心肌细胞接触面,阻断钙黏素E可抑制EPCs转分化, 表明细胞间相互作用对EPCs转分化的影响。同样, 对转分化为心肌细胞的说法, 新近也有学者提出质疑[20]。Sales等[21]研究发现体外培养的EPCs经TGF-ß1诱导10～15d后, 可以由最初的内皮表型(CD31+/vWF+/αSMA-)转变为间充质细胞表型(CD31+/α-SMA+), 同时分泌产生层黏连蛋白、纤维结合素以及Ⅰ、Ⅲ型胶原等基质, 提出EPCs可能转分化为间充质细胞, 但要确证EPCs是转分化形成间充质细胞, 而不是由EPCs中可能混杂的间充质前体细胞或者通过细胞融合机制而来, 但此发现尚需进一步的研究证实。Miyata等[22]对骨髓源细胞系TR-BME2进行研究后发现, EPCs较成熟内皮细胞高表达平滑肌细胞标志, 经PDGF-BB诱导分化形成不同表型(收缩型或合成型)的平滑肌细胞, 提示还可能分化为血管平滑肌细胞。上述研究均表明EPCs的命运不一定是直线性的, 在特定条件下可能遵循其他途径进行分化, 也就是说不同细胞所共同拥有的“EPCs状态” 是动态不稳定的, 可能在外部环境等因素影响下向其他干(祖)祖细胞状态转换, 分化为内皮细胞以外的其他细胞。
3 EPCs在骨修复中作用
3.1 EPCs改善血管新生的机制
尽管EPCs在血管新生中的作用已经被证明,但现在的问题是EPCs是如何促进血管新生的。在无组织损伤的情况下,祖细胞的作用很弱，但在缺血的组织,遗传标记的骨髓来源细胞能共同表达EC的标记蛋白,其作用差异较大(从0%到90%不等)[23] 。同样地,骨髓来源的细胞在中风后脑组织的作用如何？文献的报道差异较大。在两项研究中,一项研究结果为骨髓来源的表达内皮标志的阳性细胞达平均34%；而另一项研究则未能检测到表达内皮标志的细胞，大量(50%)的主要是在肿瘤血管生成模型中检测到。一些研究仅仅检测到血管附近的骨髓来源的细胞,但并不能表达内皮的标志蛋白[24] 。一个可能的解释就是缺血模型(如损伤或缺血的程度)会明显的影响这些细胞的作用。轻微的缺血可能很难诱导动员骨髓内皮祖细胞,而只是引起少量骨髓祖细胞发挥作用。细胞移植后的作用也可因细胞的亚群不同而不同(如纯造血干细胞与骨髓细胞)。的确,与内部动员骨髓移植细胞相比,通过静脉输入纯化的骨髓单个核细胞或扩增后的内皮祖细胞能产生更好的效果[25] 。Tie-2阳性的骨髓来源的细胞可以通过激活自杀基因阻断肿瘤的血管生成,尽管这些细胞整合进肿瘤血管,但是可以在血管附近被检测到。因此,EPCs可以与单核细胞或巨噬细胞的作用相似,其可以通过提供细胞因子和生长因子增加血管的生成。研究[10]表明: 培养的不同来源的EPCs 可以表达VEGF、HGF和IGF-1等生长因子。粘附的单核细胞可以在相似的条件下进行培养, 并释放VEGF、HGF和G-CSF,但不能表达内皮的标志蛋白；EPCs能够融入到新生血管的结构,表明在体内能参与内皮标志蛋白的表达；而输入也可以释放生长因子但不能融入血管结构的巨噬细胞,仅仅能诱导缺血后组织新生血管的少量增加。上述研究未能证实EPCs在体内参与组成血管样结构的能力,但可以改善血管新生的状况。
3.2 EPCs在骨修复中的作用
EPCs可能通过整合[26]、融合[27]、旁分泌[13]等机制参与新生血管生成和内皮细胞更新，作为种子细胞在组织工程中促进组织工程骨体内血管化。骨移植后的3个基本过程是移植物血管化、骨再生及骨端融合，其中血管化是关键环节，其作用贯穿于整个移植修复过程，对骨再生与融合的方式及效果起决定作用[28] 。体外构建的组织工程骨尤其是大体积组织工程骨植人体内后必须迅速建立充分的血供，将成骨细胞前体细胞、相关因子、营养物质及其他参与骨修复的细胞带到局部微环境中，并带走新陈代谢产生的废物及坏死和分解产物，为种子细胞的生存和发展提供营养，从整体上维持有利于这一生理过程的代谢微环境。骨组织工程的基本方法是将种子细胞接种于可吸收的生物材料中形成细胞-支架复合物植入体内，随着支架材料的降解，种子细胞持续增殖分化、分泌基质并释放细胞因子，从而加速骨缺损的修复。目前，促进组织工程骨体内血管化的研究很多，常见的有：包裹血管束法、肌肉包埋预构建带血管蒂法、血管蒂筋膜包裹法、复合血管内皮祖细胞或血管内皮细胞，以及有利于血管化的支架材料三维结构改良和促血管生成生物活性因子的基因转染及缓／控释技术等。有人 [29]发现采用粒细胞集落刺激因子动员,能有效地增加循环EPCs数量并提高人工植入材料的内皮化程度。吴雪晖等[30]研究也表明，EPCs可作为种子细胞在组织工程中促进组织工程骨体内血管化，促进骨修复。
3.3 EPCs在骨修复中治疗与应用
组织工程简单地说就是体外培养功能相关细胞种植于天然或人工合成的支架上以期获得新的有功能的组织器官,但是绝大部分组织器官需要一个微血管网络来供给养分并带走代谢产物这个网络是必不可少的，也是研究的难点之一。随着对血管内皮祖细胞在新生血管形成中作用机制研究的深入,研究者们开始尝试用内皮祖细胞来构建组织工程器官的血管网络。Schmidt等[31]从人脐血中分离培养血管内皮祖细胞将其和人血管平滑肌细胞一起接种到支架上，发现能形聚乙醇酸聚乳酸共聚物成毛细血管样结构。Schultheiss等[32]将保留血管结构的猪小肠段去细胞后接种平滑肌细胞和膀胱上皮细胞构建组织工程膀胱。在组织工程的研究的重要领域，骨组织工程研究在多个方面均取得了令人振奋的成果，并已在临床得到初步应用，被认为是组织工程中最具有前途和可行性的领域之一[33]。这些实验研究表明,采用血管内皮祖细胞来构建组织工程骨是很有希望的，且对长节段骨缺损治疗有很大的应用前景。
4 结语与展望
血管内皮祖细胞在组织工程领域有十分广阔的应用前景，但研究才刚刚起步，且仍有很多问题有待进一步解决, 如表面标志、优化的培养体系等。相信日后的研究将会在其血管表型、组织重塑过程中的作用及生物学特性等方面有所突破, 而在应用研究中则能更好的利用血管内皮祖细胞来提高治疗效率, 减少不良反应。作为组织工程种子细胞的一员,随着自体细胞治疗与基因修饰的概念的出现，EPCs也表现出了巨大的潜能，EPCs在再生医疗领域的临床应用必将得到更大的发展。
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