血管內皮祖細胞的研究進展
提 要：近幾年來，隨著對骨組織工程技術治療骨缺損方面研究的不斷深入，對組織工程骨種子細胞，尤其是血管內皮祖細胞的研究也不斷深入。本文主要綜述了血管內皮祖細胞的來源、生物學中特性、改善血管新生的機制、在骨修復中作用、治療及應用等方面的研究進展。
骨修復是由多種細胞和細胞外基質共同參與，并受多種生長因子和激素調控的復雜病理生理活動。近年來，骨組織工程技術成為骨缺損修復的研究重點，其研究多集中在種子細胞的選擇與培養。血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)最早由Asahara等[1]于1997年報道，這一發現更新了傳統意義上的出生后血管生成、血管損傷修復的理論，為缺血性疾病的治療提供了新的思路[2]。
1 EPCs的來源
現普遍認為,EPCs與造血干細胞起源于共同的干細胞-血液血管母細胞(heman-gioblast)。盡管對EPCs的定義和來源還存在著爭議,但多數研究認為,EPCs主要來源于臍靜脈血、成人外周血、骨髓[3] ,外周血中的EPCs又起源于骨髓 ,而臍血中的EPCs起源于胎兒的肝臟[4]。正常情況下,EPCs的數量極少,外周血中約為2～3個/mL,臍血中的數量約高3.5倍[5]。在含有血管內皮生長因子(vascular endothelia growth factor,VEGF)、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF）等適合 EPCs生長的培養條件下,可以大量增殖擴增[6]。從臍血、外周血、骨髓等標本中獲得的單個核細胞或CD34、CD133陽性選擇后的單個核細胞 ,在體外包被有纖維連接蛋白（fibronectin,FN）的基底上貼壁培養可形成EPCs,形態為條索狀的單層細胞[7]。Asahara等[1]報道，EPCs是一群具有游走特性，CD34、CD133、VEGFR-2+等表面標記陽性，體外培養后能增殖并分化為血管內皮細胞的前體細胞。它不僅參與胚胎血管生成，而且在臍血、外周血及骨髓中均存在能在出生后的血管新生過程中有很強的促血管生成作用，并以血管發生方式形成新生血管的EPCs[8-9]。
2 EPCs的生物學特性
2.1 EPCs的表面標記
目前對于EPCs的鑒定尚無特異性表面標志，大多學者認為CD34+細胞為造血干細胞和內皮祖細胞共同祖先細胞。Reyes等[3]的研究顯示，骨髓中的CD34+、血管內皮鈣粘蛋白-、CD133+和Flk1+的多潛能成體祖細胞(multi-potent adult progenitor cell，MAPC)是EPCs的來源。它能在VEGF、FGF、IGF-Ⅰ作用下分化為CD34+、CD133+、VEGFR-2+和Flk1+的成血管細胞，并能繼續分化為成熟血管內皮細胞，是重要的內皮細胞來源。最初的研究[10]將EPCs定義為同時表達造血干細胞表面標志CD34和內皮細胞表面標志血管內皮細胞生長因子受體-2(VEGFR-2)的細胞。隨后,Peichev等[11]發現CD133抗原僅存在于血管內皮前體細胞，成熟內皮細胞不表達CD133，因此，他們將表達CD34+、VEGFR-2+、CD133+的細胞稱為功能性血管內皮祖細胞。但有作者提出不同看法，Harraz等[12]在實驗過程中發現，CD34-細胞在條件培養液(培養過CD34+細胞的培養液)中逐漸分化出內皮細胞，因此認為CD34+細胞分泌某些未知因子刺激CD34-細胞向內皮細胞分化。Rehman等[13]報道骨髓間充質干細胞和CD34-CD14+的單核細胞在體外經VEGF等誘導也能形成有功能的血管內皮細胞。另外還有從單核巨噬細胞中誘導分化出內皮細胞的報道[14]。
2.2 EPCs的動員
動員骨髓中的祖細胞是由局部環境所決定的。激活如彈力酶、組織蛋白酶G和基質蛋白酶家族(MMPs),通過清除了基質細胞上粘附的結合,與造血干細胞整合素的作用,動員細胞因子阻礙了干細胞和基質細胞之間的相互作用,這最終就允許干細胞通過跨內皮遷移離開骨髓[15]。從生理上講,一般認為缺血可以成為誘導動員骨髓EPCs的信號。因此,缺血可以上調VEGF,并釋放到血循環并通過MMP-9 的依賴誘導動員骨髓的前體細胞。在血液學方面,已經發現包括動員骨髓干細胞其他因素,如從外周血收獲造血干細胞而用于骨髓移植。此外, 促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)可以刺激紅細胞增殖和成熟,在小鼠和人也可以增加外周血中內皮祖細胞的數量[16]。血清EPO的水平和缺血性心臟病患者骨髓內CD34+或CD133+干細胞之間的關系支持內源性EPO水平作為一個EPCs動員的生理指標而發揮重要作用。但目前還不清楚哪種動員因子對于增加EPCs最為重要。在動物實驗中，VEGF165能迅速動員造血干細胞和循環的內皮祖細胞,而血管生成素-1(angiopoietin-1)則誘導了遲發的、較弱的動員內皮和造血祖細胞的作用[17] 。此外,通過動脈保護藥物MG-CoA還原酶抑制劑(他汀類藥物)的研究,為藥物調節EPCs水平提供了第一個證據。研究[18]表明他汀類藥物在體外可以增加小鼠和穩定性冠狀動脈疾病患者的EPCs數量和功能活性。他汀類藥物可以增加骨髓內干細胞的數量,增加EPCs數量和改善EPCs功能包括EPCs的增殖, EPCs的動員和防止EPCs的衰老和凋亡。
2.3 EPCs的分化
Koyanagi等[19]發現鈣黏素E、N表達于共培養體系中EPCs-心肌細胞接觸面,阻斷鈣黏素E可抑制EPCs轉分化, 表明細胞間相互作用對EPCs轉分化的影響。同樣, 對轉分化為心肌細胞的說法, 新近也有學者提出質疑[20]。Sales等[21]研究發現體外培養的EPCs經TGF-ß1誘導10～15d后, 可以由最初的內皮表型(CD31+/vWF+/αSMA-)轉變為間充質細胞表型(CD31+/α-SMA+), 同時分泌產生層黏連蛋白、纖維結合素以及Ⅰ、Ⅲ型膠原等基質, 提出EPCs可能轉分化為間充質細胞, 但要確證EPCs是轉分化形成間充質細胞, 而不是由EPCs中可能混雜的間充質前體細胞或者通過細胞融合機制而來, 但此發現尚需進一步的研究證實。Miyata等[22]對骨髓源細胞系TR-BME2進行研究后發現, EPCs較成熟內皮細胞高表達平滑肌細胞標志, 經PDGF-BB誘導分化形成不同表型(收縮型或合成型)的平滑肌細胞, 提示還可能分化為血管平滑肌細胞。上述研究均表明EPCs的命運不一定是直線性的, 在特定條件下可能遵循其他途徑進行分化, 也就是說不同細胞所共同擁有的“EPCs狀態” 是動態不穩定的, 可能在外部環境等因素影響下向其他干(祖)祖細胞狀態轉換, 分化為內皮細胞以外的其他細胞。
3 EPCs在骨修復中作用
3.1 EPCs改善血管新生的機制
盡管EPCs在血管新生中的作用已經被證明,但現在的問題是EPCs是如何促進血管新生的。在無組織損傷的情況下,祖細胞的作用很弱，但在缺血的組織,遺傳標記的骨髓來源細胞能共同表達EC的標記蛋白,其作用差異較大(從0%到90%不等)[23] 。同樣地,骨髓來源的細胞在中風后腦組織的作用如何？文獻的報道差異較大。在兩項研究中,一項研究結果為骨髓來源的表達內皮標志的陽性細胞達平均34%；而另一項研究則未能檢測到表達內皮標志的細胞，大量(50%)的主要是在腫瘤血管生成模型中檢測到。一些研究僅僅檢測到血管附近的骨髓來源的細胞,但并不能表達內皮的標志蛋白[24] 。一個可能的解釋就是缺血模型(如損傷或缺血的程度)會明顯的影響這些細胞的作用。輕微的缺血可能很難誘導動員骨髓內皮祖細胞,而只是引起少量骨髓祖細胞發揮作用。細胞移植后的作用也可因細胞的亞群不同而不同(如純造血干細胞與骨髓細胞)。的確,與內部動員骨髓移植細胞相比,通過靜脈輸入純化的骨髓單個核細胞或擴增后的內皮祖細胞能產生更好的效果[25] 。Tie-2陽性的骨髓來源的細胞可以通過激活自殺基因阻斷腫瘤的血管生成,盡管這些細胞整合進腫瘤血管,但是可以在血管附近被檢測到。因此,EPCs可以與單核細胞或巨噬細胞的作用相似,其可以通過提供細胞因子和生長因子增加血管的生成。研究[10]表明: 培養的不同來源的EPCs 可以表達VEGF、HGF和IGF-1等生長因子。粘附的單核細胞可以在相似的條件下進行培養, 并釋放VEGF、HGF和G-CSF,但不能表達內皮的標志蛋白；EPCs能夠融入到新生血管的結構,表明在體內能參與內皮標志蛋白的表達；而輸入也可以釋放生長因子但不能融入血管結構的巨噬細胞,僅僅能誘導缺血后組織新生血管的少量增加。上述研究未能證實EPCs在體內參與組成血管樣結構的能力,但可以改善血管新生的狀況。
3.2 EPCs在骨修復中的作用
EPCs可能通過整合[26]、融合[27]、旁分泌[13]等機制參與新生血管生成和內皮細胞更新，作為種子細胞在組織工程中促進組織工程骨體內血管化。骨移植后的3個基本過程是移植物血管化、骨再生及骨端融合，其中血管化是關鍵環節，其作用貫穿于整個移植修復過程，對骨再生與融合的方式及效果起決定作用[28] 。體外構建的組織工程骨尤其是大體積組織工程骨植人體內后必須迅速建立充分的血供，將成骨細胞前體細胞、相關因子、營養物質及其他參與骨修復的細胞帶到局部微環境中，并帶走新陳代謝產生的廢物及壞死和分解產物，為種子細胞的生存和發展提供營養，從整體上維持有利于這一生理過程的代謝微環境。骨組織工程的基本方法是將種子細胞接種于可吸收的生物材料中形成細胞-支架復合物植入體內，隨著支架材料的降解，種子細胞持續增殖分化、分泌基質并釋放細胞因子，從而加速骨缺損的修復。目前，促進組織工程骨體內血管化的研究很多，常見的有：包裹血管束法、肌肉包埋預構建帶血管蒂法、血管蒂筋膜包裹法、復合血管內皮祖細胞或血管內皮細胞，以及有利于血管化的支架材料三維結構改良和促血管生成生物活性因子的基因轉染及緩／控釋技術等。有人 [29]發現采用粒細胞集落刺激因子動員,能有效地增加循環EPCs數量并提高人工植入材料的內皮化程度。吳雪暉等[30]研究也表明，EPCs可作為種子細胞在組織工程中促進組織工程骨體內血管化，促進骨修復。
3.3 EPCs在骨修復中治療與應用
組織工程簡單地說就是體外培養功能相關細胞種植于天然或人工合成的支架上以期獲得新的有功能的組織器官,但是絕大部分組織器官需要一個微血管網絡來供給養分并帶走代謝產物這個網絡是必不可少的，也是研究的難點之一。隨著對血管內皮祖細胞在新生血管形成中作用機制研究的深入,研究者們開始嘗試用內皮祖細胞來構建組織工程器官的血管網絡。Schmidt等[31]從人臍血中分離培養血管內皮祖細胞將其和人血管平滑肌細胞一起接種到支架上，發現能形聚乙醇酸聚乳酸共聚物成毛細血管樣結構。Schultheiss等[32]將保留血管結構的豬小腸段去細胞后接種平滑肌細胞和膀胱上皮細胞構建組織工程膀胱。在組織工程的研究的重要領域，骨組織工程研究在多個方面均取得了令人振奮的成果，并已在臨床得到初步應用，被認為是組織工程中最具有前途和可行性的領域之一[33]。這些實驗研究表明,采用血管內皮祖細胞來構建組織工程骨是很有希望的，且對長節段骨缺損治療有很大的應用前景。
4 結語與展望
血管內皮祖細胞在組織工程領域有十分廣闊的應用前景，但研究才剛剛起步，且仍有很多問題有待進一步解決, 如表面標志、優化的培養體系等。相信日后的研究將會在其血管表型、組織重塑過程中的作用及生物學特性等方面有所突破, 而在應用研究中則能更好的利用血管內皮祖細胞來提高治療效率, 減少不良反應。作為組織工程種子細胞的一員,隨著自體細胞治療與基因修飾的概念的出現，EPCs也表現出了巨大的潛能，EPCs在再生醫療領域的臨床應用必將得到更大的發展。
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